Анализ данных с использованием DADA2 и dadaist2

DADA2 (Callahan et al., 2016) - программа для извлечения точных вариантов последовательностей ампликонов (ASVs, Amplicon Sequence Variants). ASV представляют собой аналоги OTU, но имеют более высое разрешение (разрешающая способность может составлять даже до 1-2 нуклеотидов). Также к достоинствам ASV можно отнести их сопоставимость между разными исследованиями без необходимости повторной обработки объединенных данных.

Программа dadaist2 (Ansorge et al., 2021) представляет из себя оболочку для DADA2 и позволяет легко автоматизировать весь анализ (от обработки прочтений до статистического анализа и построения графиков).

Для начала необходимо сформировать таблицу с соответствием образцов файлам с парно-концевыми прочтениями:

cd ~
dadaist2-metadata -i data/ > metadata.tsv
cat metadata.tsv

Далее команда dadaist2 запускает пайплан DADA2, в который входит:

фильтрация данных по качеству (c помощью SeqFu; Telatin et al., 2021)
удаление участков, комплементарных праймерам (с помощью Cutadapt; Martin, 2011)
сборку парно-концевых ридов
удаление ошибок секвенирования и формирование ASV (c помощью DADA2; Callahan et al., 2016)
удаление химерных последовательностей
таксономическую аннотацию (c помощью функции assignTaxonomy)
множественное выравнивание последовательностей ASV и построение филогенетического дерева
оценку разнообразия с использованием пакета Rhea (Lagkouvardos et al., 2017)
подготвку данных для других программ - phyloseq (McMurdie, Holmes,2013) и MicrobiomeAnalyst (Chong et al., 2020)

dadaist2 \
  -i data/ \
  -m metadata.tsv \
  -d db/COIv4_DB.fa.gz \
  --primers "GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC":"TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA" \
  -t 4 \
  -l DADA2_results/DADA2_log.txt \
  -o DADA2_results

-i - директория, в которой находятся FASTQ файлы
-m - указывает на файл с метаданными
-d - путь к базе данных для таксономической аннотиации
--primers указывает на последовательности используемых праймеров (Leray et al. 2013):
- mlCOIintF - GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
- jgHCO2198 - TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
-t - количество ядер процессора
-l - файл с отчетом о выполнении программ
-o - папка с результатми анализа

Основные результаты:

dada2_stats.tsv - отчёт о количестве ридов после фильтрации
rep-seqs-tax.fasta - последовательности ASV c таксономической аннотацией в заголовках
feature-table.tsv - количество ридов ASV в образцах
rep-seqs.tree - филогенетическое дерево ASV в формате Newick
rep-seqs.msa - выравнивание последовательностей ASV

MultiQC-отчёт

В интерактивном виде также можно посмотреть отчёт о количестве ридов после фильтрации, обесшумливания, сборки парно-концевых ридов и удаления химер, а также о соотношении обилий доминирующих последовательностей с учётом их таксономического положения.

## Подготовка данных для отчёта
dadaist2-mqc-report \
  -i DADA2_results/ \
  -t 10 \
  -o DADA2_results/mqc

## Формирование MultiQC-отчёта
multiqc -c DADA2_results/mqc/config.yaml DADA2_results/qc/

## Открываем отчет в браузере (например, в Firefox)
firefox multiqc_report.html 

Rhea

В подпапке Rhea находятся результаты

анализа разнообразия образцов
```
  cat DADA2_results/Rhea/
```
таблицы с нормализированным абсолютным (OTUs_Table-norm-tax.tab) и относительным (OTUs_Table-norm-rel-tax.tab) обилием ASV в образцах
кривые насыщения ASV в зависимости от количества прочтений (RarefactionCurve.pdf)

MicrobiomeAnalyst

MicrobiomeAnalyst (Chong et al., 2020) - веб-сервер, на котором представлен модуль для анализа данных метабаркодинга (MDP, Marker Data Profiling). Его возможности простираются от нормализации данных до статистического сравнения и классификации групп образцов.

Программа dadaist2 уже заботливо помогла сформировать данные в удобном для MicrobiomeAnalyst формате и нам остаётся только загрузить их по этой ссылке:
https://www.microbiomeanalyst.ca/MicrobiomeAnalyst/upload/OtuUploadView.xhtml

В поле OTU/ASV table необходимо загрузить файл table.csv.
В поле Metadata file - файл metadata.csv.
В поле Taxonomy table - файл taxonomy.csv.
В поле Phylogenetic tree - файлrep-seqs.tree.
В графе Taxonomy labels выбрать “QIIME”.

Результаты

Результаты пайплайна доступны здесь

Ссылки

Callahan B, McMurdie P, Rosen M et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data // Nature Methods 13 (2016). DOI:10.1038/nmeth.3869
Ansorge R, Birolo G, James SA, Telatin A. Dadaist2: A Toolkit to automate and simplify statistical analysis and plotting of metabarcoding experiments // International Journal of Molecular Sciences 22 (2021). DOI:10.3390/ijms22105309
Ewels P, Magnusson M, Lundin S, Käller M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report // Bioinformatics (2016) DOI:10.1093/bioinformatics/btw354
Lagkouvardos I, Fischer S, Kumar N, Clavel T. Rhea: a transparent and modular R pipeline for microbial profiling based on 16S rRNA gene amplicons // PeerJ 5 (2017) DOI:10.7717/peerj.2836
Chong J, Liu P, Zhou G et al. Using MicrobiomeAnalyst for comprehensive statistical, functional, and meta-analysis of microbiome data // Nature Protocols 15 (2020). DOI:10.1038/s41596-019-0264-1
Leray M, Yang JY, Meyer CP et al. A new versatile primer set targeting a short fragment of the mitochondrial COI region for metabarcoding metazoan diversity: application for characterizing coral reef fish gut contents // Frontiers in Zoology 10-34 (2013). DOI:10.1186/1742-9994-10-34
Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads // EMBnet Journal 17 (2011). DOI:10.14806/ej.17.1.200
McMurdie PJ, Holmes S. phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive Analysis and Graphics of Microbiome Census Data // PLOS ONE 8-4 (2013). DOI:10.1371/journal.pone.0061217
Telatin A, Fariselli P, Birolo G. SeqFu: A Suite of Utilities for the Robust and Reproducible Manipulation of Sequence Files // Bioengineering 8 (2021). DOI:10.3390/bioengineering8050059

Примеры анализа данных с использованием: